定序的基本原理，在於針對同一條 DNA 的密碼順序，要能取得長短不一的連續片段，並知道這些片段的末端所對應的 A、T、C、G 鹼基。如此，只要把這些片段長短排序，原本 DNA 上的完整鹼基序列就可以知道。下面會用例子再作深入的說明。
至於得到大量片段的方法；可以在先大量複製待定序的 DNA之後，把 DNA 在不同鹼基上切斷。例如，限制脢會在特定的鹼基排列處把雙股螺旋的 DNA 切斷。利用移除鹼基的化學反應也可以達到在特定鹼基上切斷 DNA 的效果。另外，以原來包含完整密碼順序的 DNA 當作樣板進行複製，卻隨機地干擾使其中斷而不再增長，如此也能產生各種長度不同的片斷（）。
對不同長短之 DNA 片段作排序，用的是一種稱為膠體電泳的技術。膠體電泳可以區分出被限制脢切斷之 DNA 各片段的微小差異。其原理是，分子片段在膠體裏的流動速率與其鹼基對數目的多少取對數後呈反比，也就是說，分子片段越短，其在膠體中的漂移速率也就越快。膠體電泳對片段長短的解析力非常高，有的裝置，對於本身長度達數百個單位的兩個 DNA 片段，即便兩者長度只差一個核甘酸，都可以區分得出來。
化學切斷法定序（Maxmam-Gilbert 法）
在一股的一端上加附上一個 32P，用特定的酵素（polynucleotide kinase) 可把它加到 5' 羥基,氫氧基（hydroxyl）端。
利用加入反應物的方法可以把特定鹼基移除，讓 DNA 骨幹上出現缺口，隨後用鹼性溶劑則可讓 DNA 在缺口處斷裂。化學反
以
5'-32P-GTAGCGT-3'
為例，如果是反應到中間的 G，則成 5'-32P-GTA_CGT-3'，並隨後斷裂成 5'-32P-GTA 和 CGT-3'。
現在假設有任意的一組字碼 5'-GTAGCTA-3'，則我們大量複製（用聚合脢鏈鎖反應 PCR），再加上 32P於 5' 端，分別放入四支試管中，分別標示：切 A、切 T、切 C、切 G。接下來，各在四支試管中加入不相同特定藥劑，以便分別在各試管內進行鹼基移除與 DNA 的切斷。控制反應的時間到大部分的 DNA 都只切到一個缺口，如此，四支試管內可能的片段如下：
原待定序 DNA 之單股：32P-GTAGCGT
| 切 A | 32P-GT | GCGT |
| 切 T | 32P-G
32P-GTAGCG |
AGCGT |
| 切 C | 32P-GTAG | GT |
| 切 G | 32P-
32P-GTA 32P-GTAGC |
TAGCGT
CGT T |
這至些分子片段在稍後跑完電泳後，會在底片顯像的只有含 32P
者，因此四支試管中重要的是：
| 切 A | 32P-GT |
| 切 T | 32P-G
32P-GTAGCG |
| 切 C | 32P-GTAG |
| 切 G | 32P-
32P-GTA 32P-GTAGC |
倒入電泳，因分子片段長短不同，感光的條紋距離起跑點也有遠近之分。（在下表左邊的數字只是標示出片段的大小關係，真正的電泳則不是等間距的。）
| A | T | C | G | ||
| 8 | * | * | * | * | |
| 7 | * | ||||
| 6 | * | ||||
| 5 | * | ||||
| 4 | * | ||||
| 3 | * | ||||
| 2 | * | ||||
| 1 | * |
從斑紋出現的先後順序，可以一字不差地解讀出原 DNA 上的順序，如下：
| A | T | C | G | ||||
| 8 | * | * | * | * | |||
| 7 | * | ← | Ｔ | ||||
| 6 | * | ← | Ｇ | ||||
| 5 | * | ← | Ｃ | ||||
| 4 | * | ← | Ｇ | ||||
| 3 | * | ← | Ａ | ||||
| 2 | * | ← | Ｔ | ||||
| 1 | * | ← | Ｇ |
以上為定序基本概念的範例，實際上的操作或許有方法上的不同，但原理則相同。
若所用的移除鹼基的四種反應劑不是恰好只個別切 A、T、C、G，而是 A+G、T+C、C、G。
李明憲撰文